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盛夏干貨分享:ELISA樣本準備完全指南
點擊次數:80 發布時間:2020-07-22

    進行 ELISA 前制備樣品的提示
    請參閱隨試劑盒提供的實驗方案,了解有關樣品制備和兼容性樣品類型的產品特定詳細信息。

    該指南適用于制備 ELISA 測定法中用到的常規樣本,而好的樣品制備程序可根據所需測定靶標及測定方法作相應調整。選用新測定方法時,建議查閱相關文獻選擇與您樣本相似的實驗步驟作為參考。

    樣品制備方法

    一、細胞培養物上清液
    1.將細胞培養上清移至離心管,4℃,1,500 rpm 離心 10 分鐘。
    2.立即進行上清液的分裝并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    二、細胞提取物
    1.將細胞培養板放置在冰上。
    2.吸出培養基并用預冷 PBS 輕輕漂洗細胞一次。
    3.棄去 PBS ,向 100 mm 培養板加入 0.5ml 提取緩沖液。
    4.收集細胞,然后移至經過預冷的離心管中。
    5.短暫渦旋后冰上孵育 15-30 分鐘
    6.4℃ 13,000  rpm 離心 10 分鐘,沉淀不溶性內容物。
    7.將上清(這里是指可溶性細胞提取物)分裝至預冷的離心管中,并于 -80℃ 保存。盡可能減少反復凍融次數。

    三、條件培養基
    1.將細胞接種到含完全(含血清)生長培養基的培養容器中,使細胞增殖達到預期的融合度。
    2.棄去培養基,用預溫 PBS 小心洗滌。重復洗滌步驟。
    3.棄去 PBS 洗滌液并小心加入無血清培養基。
    4.孵育 1-2 天。
    5.將培養基移至離心管,4℃ 1,500 rpm 離心 10 分鐘。
    6.立即分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    四、乳汁
    1.收集樣品,10,000 x g 4℃離心 2 分鐘。
    2.分裝上清液并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    五、血漿
    1.將全血收集到含抗凝劑的管中,例如 BD 抗凝真空采血管(目錄號:363080/363080)或添加 0.1M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。
    2.4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。
    3.立即分裝上清(血漿)并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    六、尿液
    1.收集樣品,10,000 xg 4℃離心 2 分鐘。
    2.分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    七、唾液
    1.收集樣品,4℃ 10,000 xg 離心 2 分鐘。
    2.立即分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    八、血清
    1.將全血收集到未經處理的測試管中,或者到不含抗凝劑的管中,如 BD 血清用真空采血管。
    2.室溫孵育 20 分鐘。
    3.4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。
    4.立即分裝上清(血清)并于 -80℃ 條件下保存。避免反復凍融。

    九、組織提取物
    1.用干凈的工具解剖組織,best在冰上、盡快進行,以防止被蛋白酶降解。
    2.將組織置于圓底的微量離心管中,并浸入液氮中 “速凍”。將樣品保存在 -80℃ 以便后續使用或放置在冰上進行直接勻漿。
    3.對于約 5 mg 的組織塊,可向管中添加約 300 µl 完全提取緩沖液(查看細胞/組織提取緩沖液配方),然后用電動勻漿器勻漿。
    4.清洗刀片兩次,每次清洗使用 300µl 完全提取緩沖液,然后在 4℃ 下維持恒定攪拌 2 小時(例如置于冷室中的回旋振蕩器上)。
    5.4℃ 13,000 x rpm 離心 20 分鐘。置于冰上,將上清液(這里是指可溶的蛋白質提取物)分裝至新、預冷的管中并在 -80℃ 保存。避免反復凍融。

    裂解緩沖液的體積必須根據所用組織的量進行確定。最終蛋白質提取物的濃度一般 > 1 mg/mL。

    細胞/組織提取緩沖液配方:
    100 mM Tris,pH 7.4
    150 mM NaCl
    1 mM EGTA
    1 mM EDTA
    1% Triton X-100
    0.5% 脫氧膽酸鈉

    制備完全提取緩沖液所需的其它試劑:
    磷酸酶抑制劑混合物
    蛋白酶抑制劑混合物
    PMSF

    使用前,按照廠家描述加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物以及終濃度為1mM的PMSF。

    通用建議
    1.推薦的蛋白質提取物濃度為至少 1-2 mg/mL。
    2.通常,可用緩沖液將血清、血漿、細胞和組織提取物稀釋2倍。
    3.樣品融化后,使用前,將樣品在 4℃ 10,000 x rpm 離心 5 分鐘以除去沉淀。

 

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